（6）甘草渣总黄酮抗氧化能力测定

①甘草渣总黄酮对羟自由基（·OH）清除的面优测定甘草渣总黄酮对羟自由基（·0H）清除率按照Ren的方法进行实验。取不同浓度的化超化研甘草渣总黄酮溶液1.0mL于试管中，分别加入1.0mL10mmol/LFeSO₄溶液和10mmol/L水杨酸-乙醇溶液，声提混合均匀后加入1.0mL10mmol/LH₂O₂溶液，取甘在37℃水浴条件下反应30min，草渣在510nm波长处测定吸光度。总黄使用蒸馏水替代H₂O₂作为参比对照，酮工用蒸馏水代替样品作为空白对照，艺及计算羟自由基（·OH）清除率。抗氧另外取与提取液总黄酮同等浓度的面优维生素C溶液作为阳性对照。

式（2）中A₁为样品溶液的化超化研吸光度；A₂为参比溶液吸光度；Ao为空白溶液的吸光度。

②甘草渣总黄酮对DPPH自由基清除能力的声提测定

对DPPH自由基清除能力采用Brand的方法进行测定。取1.0mL不同浓度的取甘甘草渣总黄酮提取液于试管中，分别加入5mmol/LDPPH乙醇溶液1.0mL，草渣混合均匀后暗室静置30min，总黄取2.0mL乙醇作为空白对照，1.0mL5mmol/LDPPH乙醇溶液与1.0mL乙醇混合液作为参比对照，于517nm波长处测定吸光度，按式（3）计算DPPH自由基清除率。另外取与提取液总黄酮同等浓度的维生素C溶液作为阳性对照。

式（3）中A₁为样品溶液的吸光度；Ao为参比溶液的吸光度。

③甘草渣总黄酮总抗氧化能力测定

参考Oyaizu的方法对甘草渣总黄酮总抗氧化能力进行测定，维生素C溶液作为阳性对照。取不同浓度的甘草渣总黄酮溶液1.0mL于试管中，加入0.2mol/LpH6.6的磷酸缓冲液和1%铁氰化钾溶液各2.0mL后混合均匀，50℃水浴反应20min后立即冷却至室温，加入2.0mL10%三氯乙酸终止反应。溶液在5000r/min条件下离心10min，取上清液2.0mL，再加入2.0mL蒸馏水和0.4mL0.1%FeCl₃溶液，混匀，暗室静置反应30min后于700nm波长处测定吸光度。

（7）数据分析

用Origin9.0绘制数据图，用Design-Expert8.0进行响应面试验设计和分析，所有实验均重复3次。

二、结果与分析

1、单因素实验结果

（1）料液比对甘草渣总黄酮收率的影响

按照精确称取2.0g甘草渣，分别以料液比1:25（g:mL）、1:30（g：mL）、1:35（g:mL）、1:40（g:mL）和1:45（g:mL）的比例加入70%乙醇溶液，超声30min，在60℃下回流提取2h方法进行实验，结果如图2所示。随着溶剂用量的增多，总黄酮的收率呈先上升后下降的趋势。当溶剂用量较少时，总黄酮的收率随着溶剂用量的增多而升高，可能是由于溶剂的增加使得溶液与甘草渣能够充分接触，促进了黄酮的溶出，从而总黄酮收率也逐渐提高。当料液比为1:35时，总黄酮收率达到最大。而当料液比过大时，总黄酮收率下降，可能是由于料液比过高，造成杂质溶出过多，从而使总黄酮收率有所降低。另外，考虑到生产成本以及后续工作的工作量，选择料液比为1:35。

（2）超声时间对甘草渣总黄酮收率的影响

按照精确称取2.0g甘草渣，以料液比1:35（g:mL）的比例加入70%乙醇溶液，分别超声10min、20min、30min、40min、50min和60min，在60℃下回流提取2h中方法，固定其他条件，研究超声时间对甘草渣总黄酮收率的影响。由图3可知，当超声时间在10min～40min之间时，甘草渣总黄酮收率随着超声时间的延长快速增加，可能是因为超声作用使细胞破裂，促进总黄酮的溶出，从而提高其收率。当超声时间达到50min时，总黄酮收率有所下降，可能是因为随超声时间的延长，细胞完全破裂，杂质溶出过多，使总黄酮的溶解量减少，也可能是因为超声时间过长，破坏了总黄酮的结构，从而降低了总黄酮的收率。因而响应面优化超声时间条件水平选择30min、40min和50min。

（3）提取时间对甘草渣总黄酮收率的影响

根据精确称取2.0g甘草渣，以料液比1:35（g:mL）的比例加入70%乙醇溶液，超声40min，在60℃下分别提取lh、2h、3h和4h实验方法，固定其他条件，考察提取时间对总黄酮收率的影响，结果见图4。可以看出，总黄酮收率随着提取时间的增加呈先增大后平稳的趋势。当提取时间为2h时，总黄酮收率达到最大。之后再增加提取时间，总黄酮收率几乎没有变化。因而响应面优化提取时间条件水平选择lh、2h和3h。

（4）提取温度对甘草渣总黄酮收率的影响

按照精确称取2.0g甘草渣，以料液比1:35（g:mL）的比例加入70%乙醇溶液，超声40min，分别在50℃、60℃、70℃、80℃和90℃下提取2h试验方法对提取温度对甘草渣总黄酮收率的影响进行研究，理论上黄酮类物质易溶于热水，温度越高，总黄酮收率应该越高。但研究结果并非如此，如图5所示，随着提取温度的升高，总黄酮收率先增大后降低。当提取温度达到70℃时，温度达到最大，之后再增加提取温度，总黄酮收率反而减小，这可能是由于温度过高，黄酮类化合物较易分解，或者被氧化，导致其结构遭到破坏的缘故，也可能是因为温度过高，溶剂挥发剧烈，导致有效溶剂相对减少，从而降低了总黄酮的收率。因而响应面优化提取温度条件水平选择60℃、70℃和80℃。
 

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