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草渣在510nm波长处测定吸光度
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简介6)甘草渣总黄酮抗氧化能力测定①甘草渣总黄酮对羟自由基·OH)清除的测定甘草渣总黄酮对羟自由基·0H)清除率按照Ren的方法进行实验。取不同浓度的甘草渣总黄酮溶液1.0mL ...
(6)甘草渣总黄酮抗氧化能力测定
①甘草渣总黄酮对羟自由基(·OH)清除的面优测定甘草渣总黄酮对羟自由基(·0H)清除率按照Ren的方法进行实验。取不同浓度的化超化研甘草渣总黄酮溶液1.0mL于试管中,分别加入1.0mL10mmol/LFeSO4溶液和10mmol/L水杨酸-乙醇溶液,声提混合均匀后加入1.0mL10mmol/LH2O2溶液,取甘在37℃水浴条件下反应30min,草渣在510nm波长处测定吸光度。总黄使用蒸馏水替代H2O2作为参比对照,酮工用蒸馏水代替样品作为空白对照,艺及计算羟自由基(·OH)清除率。抗氧另外取与提取液总黄酮同等浓度的面优维生素C溶液作为阳性对照。
式(2)中A1为样品溶液的化超化研吸光度;A2为参比溶液吸光度;Ao为空白溶液的吸光度。
②甘草渣总黄酮对DPPH自由基清除能力的声提测定
对DPPH自由基清除能力采用Brand的方法进行测定。取1.0mL不同浓度的取甘甘草渣总黄酮提取液于试管中,分别加入5mmol/LDPPH乙醇溶液1.0mL,草渣混合均匀后暗室静置30min,总黄取2.0mL乙醇作为空白对照,1.0mL5mmol/LDPPH乙醇溶液与1.0mL乙醇混合液作为参比对照,于517nm波长处测定吸光度,按式(3)计算DPPH自由基清除率。另外取与提取液总黄酮同等浓度的维生素C溶液作为阳性对照。
式(3)中A1为样品溶液的吸光度;Ao为参比溶液的吸光度。
③甘草渣总黄酮总抗氧化能力测定
参考Oyaizu的方法对甘草渣总黄酮总抗氧化能力进行测定,维生素C溶液作为阳性对照。取不同浓度的甘草渣总黄酮溶液1.0mL于试管中,加入0.2mol/LpH6.6的磷酸缓冲液和1%铁氰化钾溶液各2.0mL后混合均匀,50℃水浴反应20min后立即冷却至室温,加入2.0mL10%三氯乙酸终止反应。溶液在5000r/min条件下离心10min,取上清液2.0mL,再加入2.0mL蒸馏水和0.4mL0.1%FeCl3溶液,混匀,暗室静置反应30min后于700nm波长处测定吸光度。
(7)数据分析
用Origin9.0绘制数据图,用Design-Expert8.0进行响应面试验设计和分析,所有实验均重复3次。
二、结果与分析
1、单因素实验结果
(1)料液比对甘草渣总黄酮收率的影响
按照精确称取2.0g甘草渣,分别以料液比1:25(g:mL)、1:30(g:mL)、1:35(g:mL)、1:40(g:mL)和1:45(g:mL)的比例加入70%乙醇溶液,超声30min,在60℃下回流提取2h方法进行实验,结果如图2所示。随着溶剂用量的增多,总黄酮的收率呈先上升后下降的趋势。当溶剂用量较少时,总黄酮的收率随着溶剂用量的增多而升高,可能是由于溶剂的增加使得溶液与甘草渣能够充分接触,促进了黄酮的溶出,从而总黄酮收率也逐渐提高。当料液比为1:35时,总黄酮收率达到最大。而当料液比过大时,总黄酮收率下降,可能是由于料液比过高,造成杂质溶出过多,从而使总黄酮收率有所降低。另外,考虑到生产成本以及后续工作的工作量,选择料液比为1:35。
(2)超声时间对甘草渣总黄酮收率的影响
按照精确称取2.0g甘草渣,以料液比1:35(g:mL)的比例加入70%乙醇溶液,分别超声10min、20min、30min、40min、50min和60min,在60℃下回流提取2h中方法,固定其他条件,研究超声时间对甘草渣总黄酮收率的影响。由图3可知,当超声时间在10min~40min之间时,甘草渣总黄酮收率随着超声时间的延长快速增加,可能是因为超声作用使细胞破裂,促进总黄酮的溶出,从而提高其收率。当超声时间达到50min时,总黄酮收率有所下降,可能是因为随超声时间的延长,细胞完全破裂,杂质溶出过多,使总黄酮的溶解量减少,也可能是因为超声时间过长,破坏了总黄酮的结构,从而降低了总黄酮的收率。因而响应面优化超声时间条件水平选择30min、40min和50min。
(3)提取时间对甘草渣总黄酮收率的影响
根据精确称取2.0g甘草渣,以料液比1:35(g:mL)的比例加入70%乙醇溶液,超声40min,在60℃下分别提取lh、2h、3h和4h实验方法,固定其他条件,考察提取时间对总黄酮收率的影响,结果见图4。可以看出,总黄酮收率随着提取时间的增加呈先增大后平稳的趋势。当提取时间为2h时,总黄酮收率达到最大。之后再增加提取时间,总黄酮收率几乎没有变化。因而响应面优化提取时间条件水平选择lh、2h和3h。
(4)提取温度对甘草渣总黄酮收率的影响
按照精确称取2.0g甘草渣,以料液比1:35(g:mL)的比例加入70%乙醇溶液,超声40min,分别在50℃、60℃、70℃、80℃和90℃下提取2h试验方法对提取温度对甘草渣总黄酮收率的影响进行研究,理论上黄酮类物质易溶于热水,温度越高,总黄酮收率应该越高。但研究结果并非如此,如图5所示,随着提取温度的升高,总黄酮收率先增大后降低。当提取温度达到70℃时,温度达到最大,之后再增加提取温度,总黄酮收率反而减小,这可能是由于温度过高,黄酮类化合物较易分解,或者被氧化,导致其结构遭到破坏的缘故,也可能是因为温度过高,溶剂挥发剧烈,导致有效溶剂相对减少,从而降低了总黄酮的收率。因而响应面优化提取温度条件水平选择60℃、70℃和80℃。
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